為了盡可能地檢出無(wú)菌生產(chǎn)工藝系統(tǒng)中可能會(huì)給實(shí)際產(chǎn)品造成污染的微生物, 所選用的培養(yǎng)基應(yīng)盡可能適應(yīng)廣譜微生物的生長(zhǎng), 包括細(xì)菌、霉菌和酵母菌等。驗(yàn)證試驗(yàn)前, 可用下述方法來(lái)鑒別驗(yàn)證用培養(yǎng)基的可行性。首先嚴(yán)格按照培養(yǎng)基生產(chǎn)商的要求進(jìn)行配制和滅菌, 然后將無(wú)菌培養(yǎng)基分裝至一定數(shù)量的無(wú)菌小瓶或試管內(nèi)。同時(shí), 制備好三種微生物[ 枯草芽孢桿菌(B acillus subtilis)、金黃色葡萄球菌(S tap hy lococcus au reus) 和白色念珠菌(Cand id a a l2bicans) ]的懸浮液, 菌液濃度控制為100～ 1000 個(gè)菌/ml。

　　將上述準(zhǔn)備好的無(wú)菌培養(yǎng)基分成三等份, 且每份至少兩瓶(支) , 分別加入上述菌懸液各0.1 m l。將接有枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌的培養(yǎng)基于30～ 35℃下培養(yǎng), 接有白色念珠菌的培養(yǎng)基于20～25℃下培養(yǎng)。如果在7 d 內(nèi), 每種微生物培養(yǎng)基均至少有50% 長(zhǎng)菌, 則認(rèn)為該培養(yǎng)基可用于無(wú)菌工藝驗(yàn)證試驗(yàn)。實(shí)踐證明, 營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基或大豆胰蛋白胨液體培養(yǎng)基( soybean2casein digest medium ) 均適用于培養(yǎng)基灌裝試驗(yàn)。

　　新建的或生產(chǎn)工藝進(jìn)行過(guò)重大更改后的無(wú)菌工藝生產(chǎn)線, 必須經(jīng)至少連續(xù)三批合格的培養(yǎng)基灌裝試驗(yàn)后方可證明被驗(yàn)證工藝的可靠性。常規(guī)生產(chǎn)條件下的再驗(yàn)證頻率, 每年至少兩次,每次至少灌裝一批。由于不同時(shí)間的氣候狀態(tài)不同, 務(wù)必考慮對(duì)實(shí)際生產(chǎn)操作的每個(gè)班次進(jìn)行培養(yǎng)基灌裝試驗(yàn)。如果因培養(yǎng)基灌裝試驗(yàn)不合格而重新灌裝時(shí), 灌裝時(shí)間(班次) 要與初始灌裝的時(shí)間(班次) 相同。

　　一般來(lái)說(shuō), 每只容器的灌裝體積不得少于其容積的三分之一 , 這樣才能保證有足夠數(shù)量的培養(yǎng)基與容器的內(nèi)表面充分接觸并且易于觀察到微生物的生長(zhǎng)狀況。確定培養(yǎng)基的灌裝數(shù)量時(shí)須考慮以下兩個(gè)主要因素。一是應(yīng)符合統(tǒng)計(jì)學(xué)要求, 即在95% 的置信限至少能檢出千分之一的污染率; 二是被驗(yàn)證工藝的日常實(shí)際生產(chǎn)批量。因?yàn)閷?shí)際生產(chǎn)批量與無(wú)菌工藝操作所持續(xù)的時(shí)間和灌裝速度密切相關(guān), 而培養(yǎng)基灌裝的持續(xù)時(shí)間應(yīng)足以涵蓋實(shí)際生產(chǎn)條件下的全部操作, 并且培養(yǎng)基的灌裝數(shù)量應(yīng)能反映出在等于或小于實(shí)際生產(chǎn)的灌裝速度下產(chǎn)品及容器所暴露時(shí)間“差狀況”。因此, 當(dāng)某無(wú)菌生產(chǎn)線的實(shí)際生產(chǎn)批量大于5000 瓶時(shí), 則培養(yǎng)基的灌裝批量不得少于5000 瓶,當(dāng)無(wú)菌生產(chǎn)線的實(shí)際生產(chǎn)批量多不超過(guò)5000 瓶時(shí), 則按日常大批量灌裝即可。

　　對(duì)于產(chǎn)品溶液與培養(yǎng)基溶液配制方法相似的無(wú)菌生產(chǎn)線來(lái)說(shuō), 用培養(yǎng)基替代產(chǎn)品組分完全模擬實(shí)際生產(chǎn)時(shí)的配液操作進(jìn)行培養(yǎng)基配制(按培養(yǎng)基生產(chǎn)商的要求)、除菌過(guò)濾、并將除菌后的培養(yǎng)基溶液接入一無(wú)菌接收罐。對(duì)于那些產(chǎn)品溶液配制方法與培養(yǎng)基溶液配制方法不同或是生產(chǎn)粉針劑的無(wú)菌生產(chǎn)線來(lái)說(shuō), 可按照下述方法配制無(wú)菌培養(yǎng)基。在潔凈區(qū)內(nèi), 將事先稱量好的培養(yǎng)基加入一無(wú)菌的潔凈配制罐內(nèi), 按照培養(yǎng)基生產(chǎn)商的要求配制培養(yǎng)基溶液。在無(wú)菌環(huán)境下,用無(wú)菌管路將配制罐通過(guò)一已滅過(guò)菌的裝有0. 22μm濾膜(或?yàn)V芯) 的過(guò)濾器與一無(wú)菌的儲(chǔ)罐(儲(chǔ)罐頂部的通氣口應(yīng)配有0. 2 μm 的疏水性過(guò)濾器) 連接起來(lái), 通過(guò)加壓或減壓將培養(yǎng)基溶液經(jīng)除菌過(guò)濾后轉(zhuǎn)移至無(wú)菌儲(chǔ)罐內(nèi)。過(guò)濾結(jié)束后, 檢查除菌過(guò)濾器的完好性, 如果檢查結(jié)果合格, 則無(wú)菌培養(yǎng)基制備完成。

　　模擬實(shí)際灌裝作業(yè)進(jìn)行培養(yǎng)基灌裝。灌裝容器及膠塞應(yīng)盡可能與常規(guī)生產(chǎn)時(shí)一致。灌裝時(shí), 好能模擬實(shí)際生產(chǎn)時(shí)的差狀況, 如設(shè)備維修、操作人員的更換等, 以掌握在實(shí)際生產(chǎn)條件下產(chǎn)品污染的真實(shí)資料。對(duì)粉針劑生產(chǎn)線而言, 為了驗(yàn)證實(shí)際生產(chǎn)狀態(tài)下的粉末灌裝, 可用適當(dāng)?shù)臒o(wú)菌粉末模擬灌裝, 再向瓶?jī)?nèi)注入無(wú)菌培養(yǎng)基。用于驗(yàn)證試驗(yàn)的粉末要求流動(dòng)性好、易溶于培養(yǎng)基并且沒(méi)有抑菌作用, 如乳糖或甘露醇等; 粉末滅菌可采用輻射滅菌法或環(huán)氧乙烷滅菌法; 灌裝時(shí), 每瓶?jī)?nèi)的粉末量不宜過(guò)多, 否則會(huì)對(duì)培養(yǎng)基溶液的促菌生長(zhǎng)造成不良影響, 實(shí)踐證明,每5 m l 液體培養(yǎng)基內(nèi)乳糖含量不宜超過(guò)0. 3 g。對(duì)水針劑而言, 灌裝培養(yǎng)基后可直接壓塞。對(duì)凍干劑而言, 灌裝后, 只進(jìn)行半壓塞, 模擬實(shí)際操作將半壓塞瓶轉(zhuǎn)移至凍干機(jī)內(nèi)。培養(yǎng)基的冷凍溫度不得低于3℃, 因?yàn)闇囟冗^(guò)低會(huì)使一些微生物死亡或受到損傷, 造成污染水平降低的假象, 就不能如實(shí)反映無(wú)菌工藝的實(shí)際無(wú)菌水平。模擬凍干時(shí), 適當(dāng)進(jìn)行部分真空和充氮保護(hù)模擬(請(qǐng)注意, 真空度不宜過(guò)高,否則會(huì)引起培養(yǎng)基暴沸; 充氮過(guò)量會(huì)抑制需氧性微生物的生長(zhǎng))。凍干結(jié)束后, 在腔室內(nèi)全壓塞, 然后卸出并轉(zhuǎn)移至壓蓋間壓蓋。將壓完蓋的培養(yǎng)基上下顛倒幾次以使培養(yǎng)基與膠塞及整個(gè)容器內(nèi)壁充分接觸。從壓塞至終的培養(yǎng)檢查, 應(yīng)將盛裝培養(yǎng)基瓶的托盤(pán)容器做好標(biāo)記, 以便對(duì)所出現(xiàn)的偏差進(jìn)行追溯。

　　將壓好蓋的培養(yǎng)基先置于20-25℃培養(yǎng)至少7天，然后在30!35繼續(xù)培養(yǎng)7天。培養(yǎng)期間, 可定期對(duì)灌裝培養(yǎng)基進(jìn)行目檢, 記下每次檢出的污染瓶數(shù)及出現(xiàn)污染菌的相應(yīng)托盤(pán)編號(hào)。檢查時(shí)將每瓶培養(yǎng)基在有白色光源的黑色背景下仔細(xì)目測(cè)。透明、澄清、無(wú)混濁的培養(yǎng)基判為無(wú)微生物生長(zhǎng); 如培養(yǎng)基混濁或有懸浮的菌絲或菌落, 則需作進(jìn)一步的微生物生長(zhǎng)檢查, 以確定培養(yǎng)基是否真正染菌。對(duì)已確定有微生物生長(zhǎng)的培養(yǎng)基瓶進(jìn)行仔細(xì)檢查, 看其中是否有破損, 有破損的培養(yǎng)基瓶不得納入終的結(jié)果評(píng)價(jià)。每批灌裝培養(yǎng)基的污染率可按下式計(jì)算:

　　污染率% = 污染的培養(yǎng)基瓶數(shù)×100/(灌裝總瓶數(shù)- 破損瓶數(shù))

　　將培養(yǎng)基瓶中的污染菌在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基(如大豆胰蛋白胨瓊脂、營(yíng)養(yǎng)瓊脂等) 上劃線和分離培養(yǎng)。挑取單個(gè)菌落進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察、革蘭氏染色等初步鑒別。如果需要對(duì)培養(yǎng)基灌裝結(jié)果作進(jìn)一步調(diào)查, 那么將污染菌鑒別到種, 這對(duì)偏差調(diào)查將起到非常關(guān)鍵的作用。尋找污染菌與其它資料(如環(huán)境監(jiān)控資料) 間的相關(guān)性是無(wú)菌工藝偏差調(diào)查的有效手段。